傳統(tǒng)化學(xué)方法，無(wú)法準(zhǔn)確定量，怎么辦？

示差檢測(cè)器，蒸發(fā)光檢測(cè)器，靈敏度低，滿足不了檢測(cè)限要求，怎么辦？

LC-MS，價(jià)格昂貴，適用范圍窄，怎么辦？

在整個(gè)藥品研發(fā)過(guò)程中，產(chǎn)品雜質(zhì)研究是至關(guān)重要的一環(huán)，一些特殊雜質(zhì)的檢測(cè)往往會(huì)成為項(xiàng)目開(kāi)展的限速步驟！成為困擾大家的絆腳石！

對(duì)于一些無(wú)紫外吸收的雜質(zhì)，無(wú)法采用紫外檢測(cè)器進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)，傳統(tǒng)化學(xué)顯色方法無(wú)法準(zhǔn)確定量；通用檢測(cè)器靈敏度往往達(dá)不到要求；LC-MS、GC等儀器價(jià)格較貴，且對(duì)化合物種類有一定限制。今天，給大家介紹幾種柱前衍生化法，或許可以為你提供新思路，助你解開(kāi)難題！

（一）柱前衍生化法介紹

無(wú)紫外吸收或紫外吸收很弱的物質(zhì)與帶有發(fā)色基團(tuán)或電化學(xué)活性基團(tuán)的衍生化試劑反應(yīng)，生成穩(wěn)定的、具有紫外吸收的物質(zhì)，可通過(guò)液相色譜（紫外檢測(cè)器）進(jìn)行檢測(cè)的方法。

優(yōu)點(diǎn)：

1.對(duì)用作流動(dòng)相的溶劑體系沒(méi)有限制；

2.反應(yīng)條件、反應(yīng)速率不受限制；

3.通過(guò)選擇合適的試劑以及萃取方法，消除干擾；

4.過(guò)量溶劑、試劑容易除去；

5.轉(zhuǎn)變成合適的衍生物，可使分離度改進(jìn)。

缺點(diǎn)：

1.操作過(guò)程繁瑣，容易影響定量準(zhǔn)確性；

2.復(fù)雜組分樣品衍生化反應(yīng)后，有可能產(chǎn)生多種衍生化產(chǎn)物，

給色譜分離帶來(lái)困難；

3.有時(shí)重現(xiàn)性不佳，不易連續(xù)化。

（二）常用的紫外衍生基團(tuán)/試劑

（三）常見(jiàn)的衍生方法

1）對(duì)甲苯磺酰氯可與伯胺和仲胺反應(yīng)

反應(yīng)特點(diǎn)：

①伯胺和仲胺可與對(duì)甲苯磺酰氯反應(yīng)，叔胺不與對(duì)甲苯磺酰氯反應(yīng)；

②伯胺與對(duì)甲苯磺酰氯反應(yīng)生成的對(duì)甲苯磺酰胺化合物易溶于堿性溶液；

③仲胺與對(duì)甲苯磺酰氯反應(yīng)生成的對(duì)甲苯磺酰胺化合物不溶于堿性溶液；

反應(yīng)優(yōu)點(diǎn)：水浴55℃，水浴30min時(shí)能達(dá)到較高的衍生化效率，對(duì)甲苯磺酰胺化合物紫外響應(yīng)極強(qiáng)，穩(wěn)定性高，最大吸收波長(zhǎng)229nm。

2）2，4 - 二硝基苯肼（DNPH）與羰基化合物（醛類和酮類中的羰基）反應(yīng)

反應(yīng)優(yōu)點(diǎn)：在酸性條件下，在水浴60℃，水浴20分鐘時(shí)能達(dá)到較高的衍生化效率。

3）苯甲醛/對(duì)二甲基苯甲醛與肼反應(yīng)生成苯甲醛吖嗪/對(duì)二甲氨基芐連氮黃色化合物

反應(yīng)優(yōu)點(diǎn)：20分鐘即可反應(yīng)完全，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率較高。

案例分享
1）案例一

研究思路：起始原料TGR-1D制備過(guò)程中可能會(huì)引入某致突變雜質(zhì)，結(jié)構(gòu)與TGR-1D相似，考慮將TGR-1D按照致突變雜質(zhì)進(jìn)行研究，TGR-1D無(wú)紫外吸收，GC/GC-MS等都無(wú)法達(dá)到目的，因此考慮采用對(duì)甲苯磺酰氯與結(jié)構(gòu)中的伯胺進(jìn)行柱前衍生，采用HPLC進(jìn)行測(cè)定。

衍生方法：水浴55℃，衍生30分鐘。衍生產(chǎn)物穩(wěn)定，229nm有最大吸收。

結(jié)論：經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，方法穩(wěn)定，衍生效率高，LOQ為0.36ng，為致突變雜質(zhì)研究及無(wú)紫外吸收雜質(zhì)研究提供一種研究思路。

2）案例二

研究思路：需要對(duì)起始原料乙醇胺進(jìn)行研究，該化合物無(wú)紫外吸收，GC響應(yīng)較弱，結(jié)構(gòu)為伯胺，考慮采用對(duì)甲苯磺酰氯衍生生成對(duì)甲苯磺酰胺化合物，引入較強(qiáng)共軛，可采用HPLC進(jìn)行測(cè)定。

衍生方法：水浴55℃，衍生60分鐘。衍生產(chǎn)物穩(wěn)定，229nm有最大吸收。

結(jié)論：經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，方法穩(wěn)定，衍生效率高，LOQ為0.04ng，為無(wú)紫外吸收雜質(zhì)研究提供一種研究思路。

藥物研發(fā)過(guò)程中，對(duì)于一些無(wú)紫外吸收的雜質(zhì)研究，可有多種方法，如GC、GC-MS/MS、LC-MS/MS、蒸發(fā)光檢測(cè)器（ELSD）、電噴霧檢測(cè)器(CAD)、柱前衍生等方法，各自方法均有優(yōu)缺點(diǎn)。對(duì)于結(jié)構(gòu)中有明顯可衍生基團(tuán)情況下可優(yōu)先考慮衍生，但須兼顧其他雜質(zhì)及主成分的干擾，另外需要兼顧檢測(cè)成本，綜合選擇最優(yōu)的方法有利于日常研究及監(jiān)控。